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커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 517(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

Dermanyssus gallinae는 야생 조류와 양식 가금류에 기생하는 흡혈 진드기입니다. 대부분의 발달 단계에서 혈액을 공급하는 능력과 함께 놀라울 정도로 빠른 혈액 처리로 인해 이 진드기는 매우 쇠약해지는 해충이 됩니다. 헤모글로빈이 풍부한 식단의 소화에 대한 특정 적응을 확인하기 위해 우리는 기생충의 굶주림 및 혈액 공급 단계에서 전사체를 구성하고 비교하고 중장 강화 전사체를 식별했습니다. 우리는 시스테인 프로테아제를 암호화하는 중장 전사체가 혈액 식사로 상향조절된다는 점에 주목했습니다. 전체 단백질 분해 장치를 매핑하면서 우리는 카텝신 B와 C에 대한 동족체가 누락된 시스테인 프로테아제 제품군의 감소를 확인했습니다. 우리는 진드기의 생식 능력을 촉진하는 비텔로게닌을 암호화하는 세 가지 별개의 전사체를 추가로 식별하고 계통발생학적으로 분석했습니다. 우리는 또한 haem 생합성과 페리틴 기반의 철 저장 및 조직 간 수송 시스템에 대한 성적표를 완전히 매핑했습니다. 또한 우리는 면역 신호(Toll 및 IMD 경로) 및 활성(디펜신 및 티오에스테르 함유 단백질), RNAi 및 이온 채널링(Fralaner, Fipronil 및 Ivermectin과 같은 상업용 살비제에 대한 표적 포함)과 관련된 단백질을 코딩하는 전사체를 식별했습니다. 바이러스 서열은 Illumina 판독값에서 필터링되었으며 우리는 부분적으로 새로운 바이러스인 Red mite quaranjavirus 1을 식별하여 D. gallinae의 RNA 바이러스를 설명했습니다.

Dermanyssus 진드기는 새의 혈액을 공급하는 외부 기생충입니다1. 가금류 붉은진드기(D. gallinae)는 중요하고 지속적으로 증가하는 세계 시장5의 일부인 국내 및 상업적 집약적 계란 생산2,3,4을 위한 산란계의 세계적인 해충입니다5. D. gallinae 응애는 일주일 이내에 유충 단계에서 성숙한 성충 단계로 진행되는 매우 짧은 수명 주기를 가지고 있습니다. 대부분의 발달 단계에서 혈액 공급이 필요하고 신속한 생식 역학으로 인해 D. gallinae는 매우 자극적이고 성가신 해충입니다. 혈액을 공급하는 동안 D. gallinae 응애는 인수공통감염병을 포함하여 여러 가지 중요한 동물 병원체를 숙주에게 전염시킬 수 있습니다6. D. gallinae와 관련된 수많은 바이러스와 박테리아가 발견되었지만 벡터 또는 저장고 역할을 하는 이의 능력은 소수의 병원체에 대해서만 실험적으로 뒷받침되었습니다8,9,10. 이는 특히 계란 관련 살모넬라증 및 조류 장티푸스 질환11을 유발하는 살모넬라균 10종의 전염과 조류 인플루엔자 A 바이러스12의 확산에 대해 경고합니다. D. gallinae는 또한 여러 다른 박테리아 및 바이러스 종과 연관되어 있으며 벡터 용량에 대한 실험적 확인을 기다리고 있는 증거가 있습니다2,10,13,14.

산란 생산 과정에서 진드기 감염이 암탉의 복지에 미치는 세계적인 영향에 대한 일반적인 지식에도 불구하고 신속하고 반복적인 혈액 수유, 혈액 소화, 발달 및 번식을 가능하게 하는 분자 과정에 대한 우리의 이해는 여전히 부족합니다. 이전의 전사체 연구에서는 D. gallinae 응애 전체의 전사체를 주로 발달 단계 또는 섭식 상태별 방식으로 설명했습니다. 우리의 지식을 더욱 높이기 위해 우리는 성공적인 혈액 공급 및 소화에 중요한 단백질을 암호화하는 중장 특이적 전사체를 식별하는 것을 목표로 했습니다. 이를 달성하기 위해 우리는 새로 시퀀싱되고 조립된 전사체를 비교하고, 먹이를 주지 않은 진드기에 비해 혈액 공급이 풍부한 전사체에 대한 후속 선택과 명확한 장 특이 발현을 비교했습니다. 숙주 혈액 단백질의 효소적 소화, 헴 및 철분 생물학, 난황 형성 및 선천성 면역을 포함하여 성공적인 혈액 공급에 내재된 과정에 특별한 주의가 기울여졌습니다. 그런 다음 RNA-seq 데이터는 여러 개의 독립적인 생물학적 복제물에서 준비된 cDNA 세트에 대한 RT-qPCR로 검증되었습니다. 또한 우리는 선택된 분자와 경로의 중요성을 이해하기 위해 체외 막 공급 또는 혈구에 미세 주입을 통해 소분자 억제제를 진드기에 도입하는 여러 생물학적 검정으로 RNA-seq 데이터 분석을 보완했습니다. 또한 바이러스 기원의 Illumina 판독값을 필터링하여 진드기 RNA 바이롬의 부분 조립에 사용했습니다.

54 M reads with Phred Scores of Q30 ≥ 93.90% were obtained, and these were assembled into 85,117 contigs (Supplementary Table S1). Following their annotation, bacterial contaminants were removed (Supplementary Table S2). As D. gallinae mites were fed chicken blood, consisting of nucleated white and red cells, 4% of total reads were of chicken origin, out of which (79%) were found, as expected, in the midgut transcriptome (Supplementary Fig. S1). The identified chicken sequences were filtered out and excluded from the following analyses. A total of 18,101 D. gallinae-specific contigs were deposited at the NCBI server as BioProject PRJNA597301 and Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) GIFZ00000000 and are accessible through NCBI BLAST of the TSA database. The contigs are also listed in a hyper-linked Excel sheet (see "Data availability") with available encoded predicted protein characteristics, annotations of assembled contigs according to a particular database, differential expression statistics, and predicted cellular processes. To assess the completeness of the transcriptome, we ran a BUSCO analysis of the proteome, the result of which exhibited a yield of 91.8% complete BUSCOs. The heat map generated from D. gallinae-specific contigs clearly indicated differences between transcriptomes of immature and adult stages and also highlighted differences in the abundance of transcripts in blood-fed over unfed mites (Supplementary Fig. S1)./p>16× FPKM values over unfed protonymphs and with transcripts of FPKM ≥ 1 in midguts. b The bar graph shows protein classes encoded by individual transcripts enriched by blood-feeding. Transcripts were sorted according to encoded protein class. The number of transcripts from each subclass and their FPKM values are shown. c The table shows top differentially expressed transcripts (DET) enriched, >16× FPKM values, in transcriptomes of blood-fed protonymphs (FP) over transcriptomes of unfed protonymphs (UP). Individual accession IDs are available in Supplementary Table S3. c’ RT-qPCR validation of DETs identified by RNA-seq data shown in panel (c). Data were obtained from cDNA sets synthesised from three independent RNA isolates of unfed and blood-fed mites (n = 3) and normalised to elongation factor 1 (ef1α). Means and SEMs are shown. d The table shows DETs enriched in transcriptomes of midguts over transcriptomes of whole bodies, with filters applied: Eval < e−60, coverage ≥ 90%, FPKMAdults ≥ 2. Individual accession IDs are available in Supplementary Table S4. d’ RT-qPCR validation of DETs identified by RNA-seq data shown in panel (d). Data were obtained from cDNA sets synthesised from at least four independent RNA isolates of adult females and micro-dissected midguts of adult females (n ≥ 4) and normalised to ef1α. Means and SEMs are shown. t-Test analyses: *p = 0.05–0.01; **p = 0.01–0.001; ***p = 0.0008; ****p < 0.0001; n.s. not significant. For the source data behind the graphs, see Supplementary Data S1./p>

16× FPKM values in the transcriptome of adults over transcriptomes of both mite juvenile stages, protonymphs and deutonymphs; and E-value < e−80; protein IDs are available as Supplementary Table S7. b’ RT-qPCR validation of DETs identified by RNA-seq data shown in panel (b). Data were obtained from cDNA sets synthesised from three independent RNA isolates of adult and juvenile mites (n = 3) and normalised to elongation factor 1 (ef1α). Means and SEMs are shown. For the source data behind the graph, see Supplementary Data S1. FP fed protonymphs, FD fed deutonymphs. c Maximum likelihood phylogeny of 94 arthropod vitellogenin amino acid sequences showing the positioning of three D. gallinae vitellogenin homologues within the Vg1 and Vg2 lineages. Crustacean vitellogenins were used as an outgroup. Nodal supports at the main nodes are represented by maximum likelihood bootstrap values and Bayesian inference posterior probabilities, respectively. For simplification, the homologues from non-parasitiform taxa were collapsed into triangles; numbers inside the triangle indicate the number of sequences included in each clade. For GenBank accession numbers, see Supplementary Table S8./p>

16 fold over its FPKM values in the transcriptome of FP, and at the same time, in the transcriptome of fed deutonymphs (see "Data availability"). In order to list transcripts enriched in the transcriptome of fed over UP, only transcripts with clear annotations (E-value < e−100), coverage > 10%, and FPKM in FP > 5 were considered. The transcripts were then listed according to the highest fed/unfed ratios./p>